대용량 박테리아 플라스미드 정제를 위한 DNA 추출 자동화

대용량 박테리아 플라스미드 정제를 위한 DNA 추출 자동화

원래 박테리아에서 발견된 플라스미드는 세포질 내에서 스스로 복제될 수 있는 원형 DNA 단편입니다. 원핵세포 내에서 이러한 염색체 외 DNA 분자들은 대개 생존과 병원성을 촉진하는 유전자를 포함하고 있습니다. 제한 효소나 PCR과 같은 기술 덕분에 과학자들이 DNA 단편을 잘라 플라스미드에 삽입하여 그 기능을 테스트할 수 있게 되면서, 플라스미드가 연구 성과를 이끌어낼 수 있는 잠재력이 분명해졌습니다. 그 이후로 플라스미드는 기초 및 임상 연구에서 없어서는 안 될 도구로 자리 잡았으며, 연구자들이 유전자 기능을 규명하고, 형질전환 동물을 생성하며, 치료용 단백질과 백신을 생산하는 데 기여해 왔다.¹ 과학자들이 플라스미드를 보다 효율적으로 변형할 수 있는 정교한 기술을 개발해 왔음에도 불구하고, 플라스미드 정제는 여전히 클로닝 과정에서 번거롭고 시간이 많이 소요되는 단계로 남아 있다.

플라스미드 분리 처리량 증대의 필요성

기술의 발전 덕분에 과학자들은 실험 처리량을 늘리고 새로운 발견 속도를 높일 수 있게 되었습니다. 예를 들어, 연구자들은 이제 유전자 기능 분석을 확대하기 위해 체외 및 생체 내에서 전장 유전체 CRISPR 스크리닝을 수행하고 있습니다. 스크리닝을 수행하기 위해 과학자는 각 플라스미드가 서로 다른 유전자를 표적으로 하는 짧은 가이드 RNA를 포함하는 대규모 플라스미드 라이브러리를 생성하고, 이를 DNA 절단 효소인 Cas9의 공급원과 결합한 뒤, 둘 모두를 선택한 모델 유기체에 투여합니다. 과학자들은 또한 제약 연구를 가속화하기 위해 플라스미드 기술을 도입했습니다. 유전자 치료, mRNA 치료, 백신은 모두 개발 및 생산 단계에서 플라스미드에 의존합니다. 유전자 치료 및 백신의 비바이러스성 전달을 목표로 하는 신기술들은 플라스미드 DNA에 대한 수요를 더욱 증가시킬 것으로 보입니다. 또한 연구자들은 대규모 플라스미드 라이브러리에서 생산한 재조합 단백질을 이용해 고처리량 신약 발굴 스크리닝을 수행합니다. 이러한 플라스미드 라이브러리는 수만 개의 고유한 DNA 서열로 구성되어 있기 때문에, 실험의 성공 여부는 플라스미드 생산의 자동화에 달려 있습니다.

플라스미드 DNA 추출의 대량 생산 시 발생하는 과제

세균 용해물에서 플라스미드 DNA를 분리하는 과정은 번거롭습니다. 플라스미드가 처음 발견되었을 때 과학자들이 개발한 수동 정제 프로토콜은 여전히 대량의 고순도 플라스미드 DNA를 분리하는 가장 효과적인 방법 중 하나로 남아 있습니다. 이 절차에서 과학자들은 박테리아를 용해시키고, DNA를 침전시킨 뒤, 침전물을 세척하여 물이나 완충액에 재현탁시킵니다. 형질전환이나 형질주입과 같이 고순도 DNA가 필요한 후속 응용 분야의 경우, 연구자들은 침전 과정을 반복합니다. 따라서 플라스미드 정제는 일반적으로 반복적인 수동 흡입 및 분산 단계를 수반하며, 이로 인해 과정이 지연되고

전용 플라스미드 정제 컬럼은 DNA를 결합시켜 정제를 용이하게 합니다. 그러나 이러한 컬럼을 사용하더라도 과학자들은 여전히 여러 차례의 피펫팅과 원심분리 과정을 거쳐야 합니다. 수작업 피펫팅은 노동 집약적이며 오류와 오염이 발생하기 쉬워 대규모 프로젝트에는 비실용적입니다. 또한, 연구자마다 피펫팅 기법에 미세한 차이가 있어 사용자 간 변동성이 발생하며, 이는 최종 제품의 수율과 순도에 영향을 미칩니다. 마지막으로, 대부분의 피펫은 인체공학적으로 설계되지 않아 사용자에게 신체적 부담을 주며, 이는 반복적인 피펫팅 단계가 포함된 프로토콜을 수행할 때 오류율을 더욱 높입니다.

자동화된 플라스미드 DNA 정제는 피펫팅 속도와 정확도와 관련된 문제를 해결하고 플라스미드 준비 과정을 가속화하여, 과학자들이 실험을 안정적으로 확대할 수 있도록 해줍니다. 지금까지 과학자들은 고처리량 다운스트림 응용에 필요한 수율과 순도를 충족하는 자동화된 플라스미드 정제 방법을 개발하는 데 어려움을 겪어 왔습니다.² 따라서 고처리량 플라스미드 정제는 과학자들이 연구 규모를 확대하는 데 걸림돌이 되고 있습니다.

정제 공정의 자동화

CyBio FeliX와 같은 액체 처리 시스템은 수동 피펫팅의 필요성을 줄여주고, 변동성을 감소시키면서 실험 프로토콜의 처리 시간을 대폭 단축합니다.³ CyBio FeliX는 과학자들이 수동 피펫팅에서 벗어나 반복적인 실험을 신속하게 수행할 수 있도록 지원하는 완전 자동화 시스템입니다. 과학자들은 이 액체 처리 장치를 프로그래밍하여 개별 웰, 행 또는 열, 혹은 전체 96웰 또는 384웰 마이크로플레이트에 액체를 흡입 및 분배할 수 있습니다.³ 또한, 이 소형 장비는 표준 실험실 작업대에 설치할 수 있으며 다양한 크기의 팁을 교체할 수 있는 통합 메커니즘이 탑재되어 있습니다.

SynbioCITE와 Analytik Jena의 과학자들은 CyBio FeliX 피펫팅 플랫폼을 통합한 자동화된 플라스미드 정제 방법을 개발하여, 고처리량 다운스트림 응용 분야에 적합한 양의 고순도 플라스미드 DNA를 생산할 수 있게 되었습니다.² 과학자들은 최종 산물에 박테리아 게놈 DNA가 포함되지 않도록 시중에서 구할 수 있는 실리카 필터 플레이트 플라스미드 추출 키트에 맞춰 이 프로토콜을 설계했습니다. 세포 용해 및 세포 파편 제거 후, 이 장비는 플라스미드 DNA를 결합하는 실리카 막에 시료를 도포하고, 정제된 플라스미드 DNA를 용출하기 전에 막을 세척합니다. 과학자들이 CyBio FeliX를 로봇 팔 및 벤치탑 원심분리기와 결합하면 플라스미드 정제 과정을 완전히 자동화할 수 있습니다.

실제로 이 프로토콜을 테스트한 한 연구팀은 공정 시작 1시간 30분 후 기기로 돌아와, 시퀀싱 및 박테리아 형질전환과 같은 다운스트림 응용에 충분한 DNA를 포함하는 96개의 고순도 플라스미드 정제물을 확인했습니다.² 따라서 CyBio FeliX를 플라스미드 생산 공정에 통합하면 과학자들은 시간을 절약할 수 있을 뿐만 아니라 고품질 플라스미드 DNA를 사용하여 실험 규모를 확대할 수 있습니다.

참고 문헌

1. “플라스미드의 부상,” Zymo Research, https://www.zymoresearch.com/blogs/blog/plasmids-rise-to-prominence, 2021년 10월 29일 확인.
2. L. Suckling 외, “박테리아 세포로부터의 자동화된 고처리량 플라스미드 DNA 추출,” Analytik Jena 애플리케이션 노트. https://www.analytik-jena.co.jp/fileadmin/content/pdf_lab_automation/02_Application/CyBio_Felix/AN_Plasmid-Isolation.pdf, 2021년 10월 29일 확인.
3. “Destination Lab Automation,” Analytik Jena, https://www.analytik-jena.us/fileadmin/content/products/00_general/br_LabAutomation_ProductOverview.pdf, 2021년 10월 29일 확인.